Produção de troponina cardíaca recombinante nitrada como insumo para seleção de aptâmeros específicos

Abstract

A Síndrome Coronariana Aguda (SCA), uma das principais causas das mortes relacionadas a problemas cardiovasculares no Brasil e no mundo, tem seus sinais e sintomas decorrentes do infarto do miocárdio, levando à necrose tecidual, ou da isquemia cardíaca devido ao bloqueio total ou parcial da perfusão sanguínea. O diagnóstico precoce é fundamental para aumentar a sobrevida dos pacientes. Em 2012, a troponina nitrada foi identificada como biomarcador precoce de isquemia cardíaca sem necrose. Porém, ainda é necessário e urgente o desenvolvimento de testes moleculares de alta sensibilidade e especificidade. Os aptâmeros, oligonucleotídeos de cadeia simples capazes de adotar uma conformação tridimensional que pode encaixar perfeitamente em estruturas de proteínas e interagir fortemente com elas, são uma excelente opção de método para a captura da proteína no soro dos pacientes. Entretanto, antes da criação de um novo método diagnóstico utilizando os aptâmeros, é necessária a produção e nitração da troponina in vitro tanto na versão leve, quanto na versão pesada (contendo 15N). Portanto, o objetivo deste estudo é produzir e caracterizar a troponina I cardíaca humana recombinante nitrada nas versões leve e pesada in vitro para ser utilizada como insumo na seleção da estrutura que melhor interage com a molécula de interesse, o processo chamado SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment), e posteriormente na validação de métodos quantitativos utilizando os aptâmeros. Para isso, a troponina foi expressa por bactérias BL21AI, contendo plasmídeo com gene de troponina I cardíaca humana, em meio rico LB e meio mínimo M9. O extrato proteico foi submetido à eletroforese em gel de poliacrilamida e quantificado por meio de uma curva padrão de albumina de soro bovino (BSA). Então, a troponina foi purificada, dialisada, quantificada, nitrada com peroxinitrito, digerida com tripsina e analisada e caracterizada por cromatografia líquida associada à espectrometria de massas (LCMS). As bandas de 24 kDa correspondentes à troponina foram identificadas no gel já nas primeiras avaliações. A análise por LC-MS anterior à nitração foi capaz de sequenciar e identificar 20 peptídeos da troponina. A nitração apresentou eficiência, indicando a presença de grupo nitro (NO2) nas tirosinas das posições 29 e 112, respectivamente nos peptídeos de sequência AYATEPHAK e VDKVDEERYDIEAK/VDEERYDIEAK, e com pelo menos 80% da intensidade total desses peptídeos apresentando a modificação da nitração. Diante do sucesso na produção da troponina cardíaca nitrada, já é possível a realização do SELEX e, depois que for verificada a eficiência da nitração da versão pesada, validação quantitativa do método.