Efeito da mutação pontual de dois resíduos de treonina na expressão e função do transportador de ureia mUT-A2 no transporte de água quando, expresso em oócitos da rã Lithobates Catesbeianus

Abstract

A capacidade dos rins de produzir urina mais concentrada que o plasma (osmolaridade de 290 mOsm/L H2O) quando há a necessidade de conservar água no organismo, advém dos mecanismos de concentração urinária que dependem da alta osmolaridade do interstício medular e da presença do hormônio antidiurético, os quais promovem a reabsorção de água da luz do duto coletor para o interstício e, finalmente, para a circulação sistêmica. A alta osmolaridade do interstício medular é gerada pelo acúmulo de NaCI e ureia nesta região. O transporte de ureia ocorre através dos transportadores de ureia, UTs, distribuídos ao longo das estruturas tubulares do néfron: UT-A1 expresso na membrana apical e UT-A3 na membrana basolateral do ducto coletor medular interno; UT-A2 expresso no segmento descendente fino da alça de Henle e UT-B expresso nos vasos retos descendentes. No entanto, há um debate sobre se os UTs também são importantes para facilitar, no rim, o transporte de água, que seria uma nova função atribuída aos UTs. A estrutura cristalina do UT-B de bovino revela que o UT é uma proteína homotrimérica. Cada monômero funciona como um canal para o transporte de ureia. Nesse poro monomérico foram identificados dois resíduos de treonina (Thr ou T) ?T172 e T334 ? importantes para o transporte de ureia e conservados em todas as isoformas de UTs. Nossa hipótese é que o UT-A2 é capaz de transportar água, além de ureia, através do poro monomérico para ureia. Assim, este estudo explora a permeabilidade à água do UT-A2 ? expresso no segmento descendente fino da alça, onde não há expressão de canais para água ? através de mutações pontuais para alterar resíduos conservados de Thr (T176 e T338, envolvidos com a ligação da proteína ao substrato) para Valina (V) no filtro de seletividade do poro para ureia de UT-A2. Para tal. oócitos da rã Lithobates catesbeianus foram injetados com cRNA para expressão de mUT-A2 wild type (mUT-A2WT) ou mutantes (UT-A2T176v e UT-A2T338V ) ou injetados com H2O (controle). A expressão heteróloga foi avaliada por biotinilação de proteínas de superfície e análise de Western blot. A permeabilidade osmótica à água (Pf) foi computada através de microscopia de vídeo-imagem do aumento do volume de grupo de oócitos injetados com cRNA versus oócitos injetados com H2O, controle, quando expostos á uma solução hipotônica em relação ao plasma da rã. As medidas de Pf demonstraram que os oócitos que expressam mUT-A2WT tem Pf significante maior do que aquelas dos oócitos mutantes ou controle. Portanto, nosso estudo indica, pela primeira vez, que mUT-A2 transporta água, além de ureia e, considerando que as mutações pontuais inibiram o transporte de água através de mUT-A2, provavelmente as moléculas de água atravessam a proteína através da mesma via que as moléculas de ureia. UT-A2, sendo permeável à ureia e água pode ser um importante elo para integrar a excreção renal de resíduos nitrogenados e água e possibilitar uma melhor compreensão da fisiologia e dos distúrbios do balanço da água do organismo.